Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào
Thành phần của môi trường nuôi cấy tế bào khá phức tạp bao gồm amino acids, glucose, muối, vitamins, và các chất dinh dưỡng khác được yêu cầu cho sự phát triển. Nhu cầu đối với mỗi thành phần này là khác nhau giữa các dòng tế bào, và sự khác nhau này một phần dẫn đến số lượng lớn công thức môi trường nuôi cấy. Mỗi thành phần môi trường nuôi cấy tế bào thực hiện một chức năng đặc biệt như dưới đây:
Hệ đệm
Kiểm soát pH nghiêm ngặt cho điều kiện nuôi cấy tối ưu và nhìn chung đạt được bởi sử dụng một trong hai hệ đệm:
Hệ đệm tự nhiên
Trong một hệ đệm tự nhiên, In a natural buffering system, khí CO2 cân bằng với thành phần CO3/HCO3 của môi trường nuôi cấy. Nuôi cấy với hệ đệm tự nhiên cần được duy trì trong không khí với 5- 10% CO2, do đó phải sử dụng với một tủ ấm CO2. Hệ đệm tự nhiên giá thành thấp và không độc.
Đệm HEPES
Đệm hóa học sử dụng một ion lưỡng cực, HEPES, với khả năng đệm rất tốt trong khoảng pH 7.2- 7.4 và không yêu cầu đặt trong hệ không khó có kiểm soát. HEPES tương đối đắt và khá độc ở nồng độ cao hơn đối với một số kiểu tế bào. HEPES cũng đã cho thấy tăng sự nhạy của môi trường với ảnh hưởng của ánh sáng độc được kích ứng bởi tiếp xúc với ánh sáng huỳnh quang.
Phenol đỏ (Red)
Hầu hết các môi trường nuôi cấy thương mại chứa phenol đỏ như một chất chỉ thị pH. Đây là chất cho phép người dùng theo dõi sự ổn định của pH trong quá trình nuôi cấy. Khi tế bào sinh trưởng, môi trường thay đổi màu vì pH bị thay đổi do các chất chuyển hóa được giải phóng bởi tế bào. Ở mức độ pH thấp, phenol đỏ chuyển sang màu vàng, trong khi ở mức độ pH cao hơn nó chuyển môi trường thành màu tím. Môi trường màu đỏ tươi ở khoảng pH 7.4, mức tối ưu cho nuôi cấy tế bào. Tuy nhiên, có một số nhược điểm nhất định của việc sử dụng phenol đỏ như một thành phần môi trường nuôi cấy tế bào như sau: 1) Phenol đỏ bắt trước hoạt động của một số hormone steroid đặc biệt là estrogen. Bởi vậy người ta khuyến cáo không nên sử dụng môi trường có phenol red cho nghiên cứu các tế bào nhạy cảm với estrogen như mô vú. 2) Sự có mặt của phenol đỏ trong một số công thức không huyết thanh ảnh hưởng tới sự cân bằng nội mô của natri và kali. Ảnh hưởng này có thể được trung hòa bởi sử dụng huyết thanh hoặc hormone tuyến yên của bò. 3) Phenol red ảnh hưởng với việc xác định trong các nghiên cứu trên máy flow cytometric.
Amino Acids
Amino acids là những viên gạch để tạo nên protein, và bởi vậy are chúng là thành phần bắt buộc trong mọi môi trường nuôi tế bào đã biết. Các amino acid thiết yếu phải được bao gồm trong môi trường nuôi cấy vì tế bào không thể tự tổng hợp được chúng. Chúng được yêu cầu cho sự tăng sinh tế bào và nồng độ của chúng xác định mật độ tế bào tối đa có thể đạt được. L-glutamine, một amino acid thiết yếu, là thành phần đặc biệt quan trọng. L-glutamine cung cấp nitrogen cho NAD, NADPH và các nucleotides và phục vụ như một nguồn năng lượng thứ cấp cho trao đổi chất. Nó là một amino acid không bền, sau một thời gian chuyển thành dạng mà tế bào không thể sử dụng, và bởi vậy nên được bổ sung vào môi trường ngay trước khi sử dụng. Cần cẩn trọng khi bổ sung nhiều L-glutamine hơn trong công thức môi trường ban đầu vì sự phân hủy của nó dẫn tới tích tụ amoniac, và do đó có thể ảnh hưởng có hại lên một số dòng tế bào. Nồng độ L-glutamine cho nuôi cấy tế bào động vật có vú có thể nằm trong khoảng 0.68 mM trong môi trường M199 tới 4mM trong môi trường Dulbecco’s Modified Eagles’s. Môi trường nuôi cấy tế bào động vật không xương sống có thể chứa tới 12.3 mM L-glutamine. Chất bổ sung dạng di-peptide của glutamine như glutamax là ổn định hơn và có thể thay thế glutamine cho nuôi cấy lâu dài của những tế bào chậm phát triển. Các amnino acid không cần thiết cũng có thể được bổ sung vào môi trường để thay thế các amnio acid đã được sử dụng cạn trong quá trình sinh trưởng. Việc bổ sung môi trường với các amino acid không cần thiết kích thích sinh trưởng và kéo dài khả năng sống của tế bào.
Proteins và Peptides
Protein và peptide được sử dụng phổ biến nhất là albumin, transferin, và fibronectin. Chúng là một phần quan trọng của môi trường nuôi cấy không huyết thanh. Huyết thanh giàu protein bao gồm albumin, transferrin, aprotinin, fetuin, và fibronectin. Albumin là protein chính trong hoạt động máu gắn với nước, muối, các acid béo tự do, hormone, và vitamin, và vận chuyển chúng giữa mô và tế bào. Khả năng gắn của albumin khiến chúng là một chất loại bỏ độc tính thích hợp khỏi môi trường nuôi cấy tế bào. Aprotinin là một tác nhân bảo vệ trong hệ thống nuôi cấy tế bào, bền ở pH acid và trung tính và kháng với nhiệt độ cao và sự phá hủy bởi enzyme proteolytic. Nó có khả năng ức chế một số protease serine như trypsin. Fetuin là một glycoprotein được thấy trong huyết thanh thai nhi và sơ sinh ở nồng độ lớn hơn giai đoạn trưởng thành. Nó cũng là chất ức chế protease serine. Fibronectin đóng mọi vai trò quan trọng trong bám dính tế bào. Transferrin là một protein vận chuyển protein mà hoạt động cung cấp ion tới màng tế bào.
Axit béo và Lipid
Chúng là một phần quan trọng trong môi trường không huyết thanh vì nhìn chung chúng có mặt trong huyết thanh.
Vitamin
Nhiều vitamin là thiết yếu cho sự sinh trưởng và tăng sinh tế bào. Vitamin không thể được tổng hợp với số lượng đủ bởi tế bào và bởi vậy việc bổ sung được yêu cầu trong nuôi cấy mô, tế bào. Huyết thanh là nguồn cung cấp chính của vitamin trong nuôi cấy tế bào, tuy nhiên các vitamin được sử dụng với lượng khác nhau để khiến chúng thích hợp với các dòng tế bào khác nhau. Vitamin nhóm B được bổ sung phổ biến nhất cho kích thích sự sinh trưởng.
Các nguyên tố dạng vết (vi lượng)
Các nguyên tố dạng vết thường được bổ sung vào môi trường không huyết thanh để thay thế những chất thường thấy trong huyết thanh. Các nguyên tố dạng vết như đồng, kẽm, selenium và axit tricarboxylic là các nguyên tố hóa học gián tiếp được yêu cầu cho sự sinh trưởng thích hợp của tế bào. Những vi chất này cần thiết cho nhiều quá trình sinh học, ví dụ việc duy trì chức năng của enzyme.
Các chất bổ sung vào môi trường
Môi trường phát triển toàn diện được khuyến cáo cho nhiều dòng tế bào xác định yêu cầu các thành phần bổ sung mà không có mặt trong môi trường cơ bản và huyết thanh. Những thành phần và chất bổ sung này giúp duy trì tăng sinh và duy trì trao đổi chất tế bào bình thường. Mặc dù các chất bổ sung giống hormone, các nhân tố phát triển và các chất tín hiệu được yêu cầu cho sự phát triển bình thường của một số dòng tế bào, tuy nhiên cần có những biện pháp phòng ngừa sau đây: vì việc thêm chất bổ sung có thể thay đổi áp suất thẩm thấu của môi trường nuôi cấy mà có thể ảnh hưởng tiêu cực lên sự sinh trưởng tế bào, tốt nhất luôn kiểm tra lại áp suất thẩm thấu sau khi chất bổ sung được thêm vào. Đối với hầu hết các dòng tế bào, áp suất thẩm thấu tối ưu nên nằm trong khoảng 260 mOSM/kg tới 320 mOSM/kg. Hạn sử dụng của môi trường thay đổi sau khi thêm chất bổ sung. Môi trường toàn diện chứa chất bổ sung có xu hướng phân hủy nhanh hơn môi trường cơ bản.
Kháng sinh
Mặc dù không được yêu cầu cho sự sinh trưởng tế bào, kháng sinh thường được sử dụng để kiểm soát nhiễm nấm và vi khuẩn. Việc sử dụng thường quy cho nuôi cấy tế bào không được khuyến cáo vì môi trường vẫn có thể nhiễm vi khuẩn kháng kháng sinh và mycoplasma. Hơn nữa, kháng sinh có thể cũng ảnh hưởng với trao đổi chất của các tế bào nhạy cảm.
Huyết thanh trong môi trường nuôi cấy
Huyết thanh là một hỗn hợp phức tạp của albumins, các nhân tố sinh trưởng (growth factors) và các chất ức chế sinh trưởng. Huyết thanh là một trong thành phần quan trọng nhất của môi trường nuôi cấy tế bào và phục vụ như nguồn cung cấp amino acids, proteins, vitamins (đặc biệt vitamin tan trong chất béo như A, D, E, và K), carbohydrate, lipid, hormone, các nhân tố sinh trưởng, khoáng chất, và các nguyên tố dạng vết. Huyết thanh từ thai bò và bê được sử dụng phổ biết để hỗ trợ sự sinh trưởng của tế bào trong nuôi cấy. Huyết thanh thai là nguồn giàu các nhân tố phát triển và thích hợp cho nhân dòng tế bào và cho sự tăng trưởng nhanh của các tế bào khó tính. Huyết thanh bê được sử dụng trong các nghiên cứu ức chế tiếp xúc bởi vì các đặc tính thúc đẩy sinh trưởng thấp hơn của nó. Môi trường nuôi cấy thông thường chứa 2-10% huyết thanh. Việc bổ sung môi trường với huyết thanh nhằm các mục đích sau:
- Huyết thanh cung cấp chất dinh dưỡng cơ bản (cả trong dạng dung dịch cũng như được gắn với protein) cho tế bào.
- Huyết thanh cung cấp một số nhân tố sinh trưởng và hormone được bao gồm trong thúc đẩy tăng trưởng và chức năng tế bào chuyên biệt.
- Nó cung cấp một số protein gắn như albumin, transferrin, cái mà có thể mang các phân tử khác nhau vào trong tế bào. Ví dụ: albumin màng lipid, vitamins, hormone… vào trong tế bào. Nó cũng cung cấp protein như fibronectin, chất này thúc đẩy sự bám dính tế bào với chất nền.
- Nó cũng cung cấp các nhân tố lan rộng mà giúp tế bào trải rộng ra trước khi bắt đầu phân chia.
- Nó cung cấp các chất ức chế protease do đó bảo vệ tế bào khỏi ly giải.
- Nó cũng cung cấp chất khoảng như Na+, K+, Zn2+, Fe2+…
- Nó tăng độ nhớt của môi trường và bởi vậy bảo vệ tế bào khỏi tổn thương cơ học trong quá trình rung lắc huyền dịch nuôi cấy.
- Nó cũng hoạt động như một đệm. Do sự có mặt của cả các nhân tố sinh trưởng và các chất ức chế sinh trường, vai trò của huyết thanh trong nuôi cấy tế bào là rất phức tạp. Không may thay, cùng với việc cung cấp nhiều chức năng khác nhau, việc sử dụng huyết thanh trong các ứng dụng nuôi cấy mô vẫn có một số nhược điểm. Bảng dưới đây thể hiện các ưu điểm và nhược điểm của việc sử dụng huyết thanh.
Nuôi cấy bổ sung huyết thanh Ưu điểm Nhược điểm – Huyết thanh chứa nhiều nhân tố sinh trưởng và hormone mà kích thích tế bào sinh trưởng và có chức năng – Thiếu sự đồng nhất về thành phần của huyết thanh – Giúp tế bào bám dính – Cần kiểm nghiệm để duy trì chất lượng của mỗi mẻ trước khi sử dụng – Hoạt động như nhân tố giãn rộng – Có thể chứa một số nhân tố ức chế sinh trưởng – Hoạt động như tác nhân đêm mà giúp duy trì pH cho môi trường nuôi cấy – Tăng nguy cơ nhiễm – Chức năng như protein mang – Sự có mặt của huyết thanh trong môi trường có thể ảnh hưởng với sự tinh sạch và phân lập sản phẩm nuôi cấy – Tối thiểu tổn thương cơ học hoặc tổn thương gây ra bởi nhớt –
Trên đây là bài viết về thành phần môi trường nuôi cấy tế bào do chúng tôi lược dịch một đoạn trong bài viết về chủ đề này của tác giả Meenakshi Arora. Chúng tôi hy vọng bài viết sẽ hữu ích với các bạn. Chúng tôi mong nhận được sự ủng hộ và góp ý của Quí khách.
