Phương pháp nhuộm đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng
Việc đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng trong tinh dịch là công việc thường quy trong phân tích tinh dịch đồ theo hướng dẫn của WHO năm 2010. Để tính ra được tỷ lệ sống của tinh trùng trong tinh dịch, các chuyên viên nam học dựa vào đặc tính bán thấm của màng tế bào tinh trùng, nghĩa là tinh trùng sống sẽ thấm chọn lọc với các chất nhuộm còn tinh trùng chết thì không. Có hai quy trình nhuộm được đưa ra trong hướng dẫn của WHO năm 2010 cho việc xác định tỷ lệ sống chết của tinh trùng là: Nhuộm Eosin và Nigrosin hoặc chỉ nhuộm với Eosin.
Phương pháp nhuộm Eosin – Nigrosin
a. Nguyên lý của phương pháp nhuộm đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng:
Tinh trùng sống: có màng tế bào còn nguyên vẹn nên không bắt màu với thuốc nhuộm Eosin, do đó tinh trùng sống dưới kính hiển vi sẽ có màu trắng và nổi bật hơn với nền màu đen của Nigrosin
Tinh trùng chết: do có màng không toàn vẹn nên bắt màu đỏ hoặc hồng với thuốc nhuộm Eosin
b. Chuẩn bị thuốc nhuộm:
- Eosin 1%: 1 g Eosin và 100 ml nước cất.
- Nigrosin 10% 10g Nigrosin và 100 ml nước cất (Nigrosin cho hình nền màu tím đen để dễ phân biệt tinh trùng sống chết).
- Đun sôi hỗn hợp, để nguội ở nhiệt độ phòng.
- Lọc qua màng lọc, bảo quản trong bình tránh sáng ở nhiệt độ phòng.
c. Quy trình:
1. Trộn đều mẫu
2. Dùng micropipette hút 50 µl tinh dịch đã trộn đều cho vào hộp Nunc.
3. Nhỏ 1 giọt Eosin 1% tương đương 50 µl vào hộp Nunc chứa tinh dịch. Lắc đều hỗn hợp trong 30 giây.
4. Nhỏ 2 giọt Nigrosin 10% tương đương 100 µl vào trong hỗn hợp trên và lắc đều trong 30 giây.
5. Trộn đều mẫu và tạo tiêu bản, để khô tự nhiên.
6. Quan sát tiêu bản dưới vật kính dầu 100X.
7. Đếm tinh trùng sống và chết bằng máy bách phân.
8. Đánh giá 200 tinh trùng trên mỗi mẫu.
9. Tính phần trăm tinh trùng sống/chết, tỉ lệ trung bình và tỷ lệ khác biệt giữa 2 lần đếm.
10. So sánh với tỷ lệ khác biệt cho phép. Nếu khác biệt vượt quá số cho phép: tạo tiêu bản khác, đánh giá lại. Nếu khác biệt chấp nhận được: lấy trị số trung bình.
11. Tính phần trăm tinh trùng sống/chết.
Tinh trùng có đầu màu đỏ (D1) hay hồng đậm (D2) được coi là chết (tổn thương màng), còn tinh trùng có đầu trắng (L) hoặc hồng nhạt được coi là sống (màng nguyên vẹn).
2. Phương pháp nhuộm Eosin đơn thuần
Đây là phương pháp đơn giản, nhanh, để đánh giá tỷ lệ sống của tinh trùng tuy nhiên không thể lưu trữ được do tiêu bản đánh giá là tiêu bản ướt.
a. Chuẩn bị thuốc nhuộm:
1. NaCl 0,9%: hoà tan 0,9 g NaCl vào 100ml nước cất.
2. Eosin Y 0,5%: hoà tan 0,5 g Eosin Y vào 100ml NaCl 0,9%.
b. Quy trình:
- Trộn đều mẫu.
- 5 μl tinh dịch + 5 μl eosin, trộn đều trên lam bằng đầu tip. Đậy lamelle, để yên mẫu trong 30 giây. Có thể sử dụng nigrosin để tăng độ tương phản của nền tiêu bản.
- Đếm tinh trùng bằng kính hiển vi phản pha (20X hoặc 40X).
- Đánh giá 100 tinh trùng. Tinh trùng sống chỉ bắt màu ở một phần vùng cổ, phần còn lại của vùng đầu không bắt màu.
- Tính phần trăm tinh trùng sống/chết.
Nếu tinh trùng bắt màu thuốc nhuộm một phần ở cổ và phần đầu không nhuộm màu thì được coi là do thủng màng cổ. Đây không phải là dấu hiệu của tinh trùng chết hay phân huỷ toàn bộ màng nên những tinh trùng này được coi là sống.
