Các loại Taq polymerase
Taq polymerase
Taq polymerase (thường được viết tắt là “Taq pol” hoặc “Taq”) là một ADN polymerase bền nhiệt được sử dụng trong PCR, ban đầu được phân lập từ Thermus aquaticus, một loài vi khuẩn ưa nhiệt được thấy trong suối và miệng giếng nước nóng. PCR tận dụng khả năng chịu nhiệt độ cao của Taq được yêu cầu trong bước biến tính để tách hai sợi ADN. Với một nhiệt độ hoạt động tối ưu là 75-80°C, Taq polymerase có thể được tái sử dụng qua một vài chu kỳ PCR mà không bị biến tính bởi nhiệt. Taq polymerase cũng thể hiện khả năng cao trong việc sao chép với 1kb ADN trong vòng 30-60 giây trong PCR. Taq DNA polymerases cũng thể hiện đặc tính exonuclease chiều 5′-3′ cho phép cắt các nucleotide từ đầu 5′ của sợi ADN trong phản ứng dịch mã qua khe (Nick translation). Hoạt động này là quan trọng vì nó sẽ tách các đầu dò oligo đã được đánh dấu từ đầu 5′ của ADN để tạo các tín hiệu có thể xác định được trong ứng dụng real-time PCR.
Một trong những nhược điểm chính của Taq là mất khả năng đọc sửa vì thiếu hoạt tính exonuclease 3′-5′, bởi vậy dẫn đến độ chính xác nhân bản thấp (1 lỗi trong 9000 cặp bazơ). Đối với PCR thường quy với các đoạn nhân bản ngắn, hay các ứng dụng trong đó kết hợp các nucleotide không chuẩn như deoxyuridine hay inosine là cần thiết, khả năng xử lý cao và độ chính xác thấp của Taq mang đến nhiều thuận lợi hơn. Thiếu hoạt động đọc sửa 3’-5’ cũng dẫn đến thừa một adenine ở đầu 3′ của mỗi sợi, tạo đoạn ADN với đầu dính. Một sử dụng tiềm năng của các sản phẩm này là trong nhân dòng, ở đó chúng có thể được nối trực tiếp vào một vector plasmid chứa đầu thymine ở 3′.
Pfu DNA Polymerase
Pfu DNA polymerase là một enzyme bền nhiệt đầu tiên được phân lập từ Pyrococcus furiosus, một loài vi khuẩn cổ sống ở nhiệt độ cao. Tương tự với Taq, Pfu DNA polymerase có thể được tái sử dụng trong suốt các chu kỳ PCR vì nó hoạt động tối ưu ở 90°C và không bị biến tính bởi các bước tăng nhiệt. Hơn nữa, Pfu DNA polymerase biểu hiện hoạt tính exonuclease 3’-5’ và bởi vậy có khả năng đọc sửa bởi cắt những nucleotide kết hợp sai, giúp nó có khả năng tái bản chính xác cao (1 lỗi trong 1.3 triệu cặp bazơ.
Một cản trở của khả năng tái bản của Pfu DNA polymerase là tốc độ chậm của nó, vì nó yêu cầu tới 2 phút để khuếch đại 1 kb ADN trong một chu kỳ PCR. Pfu DNA polymerase cũng tạo các sản phẩm ADN với đầu bằng, cần sử dụng các vector đầu bằng cho ứng dụng nhân dòng.
KOD DNA Polymerase
KOD DNA polymerase là một ADN polymerase tái tổ hợp được nhận từ vi khuẩn ưa nhiệt solfatara dòng Thermococcus kodakaraensis KOD1. KOD DNA polymerase có chức năng tối ưu ở 85°C và biểu hiện hoạt tính đọc sửa exonuclease 3′-5′, tạo các sản phẩm ADN đầu bằng. Trong khi KOD DNA polymerase biểu hiện khả năng tái bản chính xác cao đối với các đoạn nhỏ, các đoạn khuếch đại lớn quá 5 kb có xu hướng thu được ít sản phẩm do hoạt tính exonuclease 3′-5′ mạnh của nó. Việc này có thể được tránh bởi trộn với KOD polymerase tự nhiên với các đột biến hoạt tính exonuclease 3′-5′ thấp, cho phép khuếch đại chính xác các đoạn lớn lên tới 15 kb.
Long-Range DNA polymerase
Trong khi PCR truyền thống có thể được sử dụng để khuếch đại các đoạn lên tới 3-4 kb, Taq DNA polymerase được tối ưu hóa nhất cho khuếch đại các đoạn nhỏ hơn 2 kb. Taq DNA polymerase thiếu hoạt tính exonuclease 3′-5′ làm cho nó không thể loại bỏ các bazơ ghép cặp lỗi, làm cho nó dừng lại mà không hoàn thành toàn bộ trình tự. Trên các đơn vị nhân bản lớn, sự tích lũy của nhiều vị trí không trùng khớp có thể ức chế PCR, dẫn tới các sản phẩm ngắn hơn.
Long-range DNA polymerase được tối ưu hóa cho các đoạn ADN lên tới 20 kb. Những polymerase này kết hợp với một polymerase bền nhiệt thường là Taq cho hiệu quả cao, với một enzyme có hoạt tính exonuclease 3′-5′ để tăng sự nhân bản chính xác. Polymerase đọc sửa thường được nhận từ một nguồn tái tổ hợp và làm việc để loại bỏ những lỗi không chính xác của Taq ở đầu 3′ khi kéo dài chuỗi.
Hot-start DNA Polymerase
Hot-start DNA polymerases được sử dụng để tăng sản phẩm bởi giảm khuếch đại không đặc hiệu trong PCR. Vì hầu hết các DNA polymerase có thể hoạt động thậm chí ở nhiệt độ phòng, việc kết hợp các thành phần phản ứng trong khi thực hiện quy trình PCR có thể dẫn tới gắn mồi không đặc hiệu với nhau hoặc với khuôn. Những mồi được gắn không đặc hiệu này cạnh tranh Taq gắn vào và kéo dài để tạo các sản phẩm phụ PCR.
Trong hot-start PCR, DNA polymerase, luôn là Taq hoặc Pfu DNA polymerase, được cải tiến hóa học hoặc được gắn kháng thể để giữ bất hoạt trong quá trình nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ gắn mồi. Khi được làm ấm trong bước biến tính ban đầu, các chất ức chế hóa học hoặc kháng thể sẽ bị bất hoạt hoặc tách ra khỏi DNA polymerase, bởi vậy khiến DNA polymerase hoạt động trở lại và bắt đầu tổng hợp nucleotide.
Hot-start PCR có ích cho việc khuếch với lượng khuôn mẫu ADN thấp, các khuôn mẫu ADN phức tạp cao hoặc trong phản ứng multiplex PCR khi nhiều cặp mồi được sử dụng, vì nó có thể cải thiện đáng kể sự đặc hiệu và năng suất tạo sản phẩm. Tuy nhiên, vì chúng thiếu hoạt tính đọc sửa, sự nhân bản chính xác của hot-start polymerases bị hạn chế và không thích hợp cho áp dụng cho nhân bản hoặc tạo đột biến sau đó.
Bst DNA Polymerase
Bacillus stearothermophilus là một loài vi khuẩn ưa nhiệt phổ biến ở môi trường đất, suối nước nóng, và môi trường trầm tích đại dương. Bst DNA polymerase được phân lập từ loài này biểu hiện hoạt tính giống như helicase là tháo xoắn sợi đôi ADN bên cạnh hoạt tính polymerase. Bst polymerase có chức năng tối ưu ở 60-65°C, nhưng biến tính trên 70 độ, khiến nó thích hợp hơn cho khuếch đại đẳng nhiệt vòng lặp trung gian (LAMP) cái mà không trải qua các bước biến tính nhiệt độ cao và chu kỳ nhiệt được sử dụng trong PCR. Trong khi Bst polymerase có hoạt tính exonuclease 5′-3′ nó không có khả năng đọc sửa vì thiếu hoạt tính exonuclease 3′-5′.
Bsu DNA Polymerase
Bsu DNA polymerase được phân lập từ bacillus subtilis một vi khuẩn đất phát triển tốt ở nhiệt độ vừa phải. Bsu DNA polymerase hoạt động tối ưu ở 25-30° và bị biến tính ở 75°C, khiến nó không thích hợp cho PCR. Bsu polymerase không thể đọc sửa vì thiếu hoạt tính exonuclease 3’-5’. Mặt khác, tiểu phần lớn mang hoạt tính exonuclease 5′-3′ được cắt ra và có thể được sử dụng trong các ứng dụng thay thế sợi đẳng nhiệt.
Tth polymerase
Tth polymerase được nhận từ Thermus thermophilus, một loài vi khuẩn ưa nhiệt ở miệng núi lửa. Tth DNA polymerase có chức năng tối ưu ở 75°C với khả năng xúc tác cao, nhưng thiếu hoạt tính đọc sửa exonuclease 3′-5′. Tth DNA polymerase biểu hiện hoạt tính phiên mã ngược hiệu quả trong sự có mặt của ion Mn, cho phép nó tổng hợp cDNA từ RNA. Bởi vì đặc tính này, Tth polymerase có thể được sử dụng cho RT-PCR, sau đó bởi khuếch đại các sản phẩm cDNA trong sự có mặt của ion Mg. Tth polymerase tạo các sản phẩm ADN với đầu dính.
Pwo DNA polymerase
Pwo DNA polymerase được nhận từ vi khuẩn cổ siêu nhiệt Pyrococcus woesei được thấy trong môi trường sâu dưới đáy đại dương. Pwo polymerase có chức năng tối ưu ở 100-103°C, và biểu hiện hoạt tính đọc sửa exonuclease 3′-5′ cao, giúp mang lại cho nó độ trung thực cao hơn gấp 18 lần so với Taq polymerase. Pwo polymerase tạo các sản phẩm đầu bằng.
Trên đây là thông tin về các loại DNA polymerase được ứng dụng trong các phản ứng PCR. Chúng tôi hy vọng những thông tin trên sẽ hữu ích với các bạn đang làm kỹ thuật sinh học phân tử. Bên cạnh đó Bimetech cung cấp nhiều sản phẩm hóa chất thiết bị cho lĩnh vực sinh học phân tử như: máy điện di, bộ lọc chân không, formamide, phenol crystal, xanh methylene… Chúng tôi rất hy vọng nhận được sự ủng hộ của Quí khách.
