Nguyên lý nhuộm Hematoxylin
Nhuộm hematoxylin được sử dụng phổ biến nhất trong các quy trình nhuộm thường quy được thực hiện trong các phòng thí nghiệm mô học và giải phẫu bệnh. Hơn nữa các quy trình dựa vào hematoxylin là một trong các kỹ thuật lâu đời nhất trong phòng thí nghiệm vì một số công thức của dung dịch của nó đã ra đời hơn 100 năm. Giá trị của hematoxylin nằm ở khả năng của dung dịch nhôm hematoxylin để nhuộm nhiễm sắc thể của nhân tế bào. Mặc dù có nhiều tiến bộ gần đây trong sinh học tế bào và bệnh lý phân tử đã dẫn tới sự cải thiện lớn trong thực hành chẩn đoán bệnh, những thay đổi trong kiểu hình nhiễm sắc thể cùng với các biến đổi về kích thước và hình thái nhân được bộc lộ bởi hematoxylin vẫn là chỉ thị chẩn đoán quan trọng trong đánh giá thay đổi bệnh học. Mặc dù sự quan trọng và liên quan của hematoxylin trong chẩn đoán bệnh, bản chất hóa học của nó vẫn được hiểu biết rất ít. Dưới đây chúng tôi sẽ tổng kết những kiến thức hiện nay về nguyên lý của các dung dịch thuốc nhuộm hematoxylin với nhôm và cơ chế nhuộm của chúng.
Sự ô xi hóa và hình thành của Hematein
Hematoxylin là một sản phẩm tự nhiên được tách chiết từ tâm gỗ của vây vang (Haematoxylin campechianum). Hematoxylin không màu và nếu không có cải biến gì sẽ có ít hoặc không có giá trị như một thuốc nhuộm sinh học. Việc sử dụng thuật ngữ “hematoxylin” để mô tả một dung dịch nhuộm có vẻ không đúng lắm tuy nhiên nó vẫn tiếp tục được sử dụng vì sự tiện ích. Để tạo thuốc nhuộm chức năng, hematoxylin được ô xi hóa thành hematein và sau đó được gắn với một trong một số ion kim loại bao gồm nhôm (Al+3), sắt (Fe+3) và crôm (Cr+3). Một ion kim loại được gắn với thuốc nhuộm mà được bao gồm trong việc gắn thuốc nhuộm với mô được coi là một thuốc ăn màu. Trong bài này chúng tôi sẽ giải thích rõ về mặt hóa học của hematoxylin gắn với nhôm và tạo thành một chất nhuộm nhân.
Để thực chuyển hematoxylin thành hematein cần cần sự hoạt động của một số tác nhân khác. Một số công thức cũ hơn như Delafield’s và Ehrlich’s dựa vào ô xi khí quyển cho sự ô xi hóa. Trong những công thức đó, hematoxylin và muối nhôm được bảo quản trong lọ để lỏng nắp hoặc chai nắp cotton để giúp nhanh quá trình ô xi hóa. Quá trình sục khí qua dung dịch hematoxylin cũng được sử dụng để tăng tốc độ quá trình ô xi hóa. Do cần kéo dài 4-10 tuần để “chín tự nhiên” hoặc ô xi hóa hematoxylin dưới những điều kiện này, những quy trình này hiếm khi được sử dụng hiện nay. Hầu hết các công thức hiện nay kết hợp một chất ô xi hóa như sodium iodate mà nhanh chóng chuyển hematoxylin thành hematein. Nồng độ của sodium iodate điển hình dựa trên lượng hematoxylin và luôn nằm trong khoảng 0.10 to 0.20 gram của sodium iodate trên một gram hematoxylin. Ô xít thủy ngân được sử dụng như chất ô xi hóa được lựa chọn trong công thức Harris trong nhiều năm nhưng không còn được sử dụng do vấn đề môi trường liên quan tới thủy ngân. Hiện nay, ô xít thủy ngân được thay thế với sodium iodate trong công thức Harris cải tiến.
Ngược lại với hematoxylin cái mà đã được xác định rõ đặc điểm cấu trúc, cấu trúc phân tử của hematein vẫn bị tranh cãi trong những năm gần đây. Cấu trúc của hematein bao gồm một vòng được mô tả trong hình bên dưới. Bất kể cấu trúc chính xác của hematein, chúng ta có thể giả thiết rằng hematein cấu trúc tương tự với hematoxylin dựa trên phân tích NMR và tương đương về trọng lượng phân tử. Thay đổi về cấu trúc dẫn tới chuyển hematoxylin tương đối không màu thành hematein nâu/ hơi đỏ. Hơn nữa, sự ô xi hóa với hematein cần thiết để gắn các ion kim loại như aluminum.
Sự hình thành màu nhuộm của hematoxylin
Một số muối nhôm khác được sử dụng như một nguồn ion Al+3. Những muối này bao gồm aluminum ammonium sulfate [AlNH4(SO4)2], aluminum sulfate [Al2(SO4)3] và aluminum potassium sulfate [AlK(SO4)2]. Các công thức Mayer’s và Harris điển hình chứa AlNH4(SO4)2 hoặc AlK(SO4)2 trong khi công thức Gill chứa Al2(SO4)3. Có thể có sự khác biệt nhỏ giữa muối nhôm hơn là lượng ion Al+3 mà mỗi muối có thể đóng góp vào dung dịch. AlNH4(SO4)2 và AlK(SO4) 2 có độ tan hạn chế trong nước và dưới hầu hết điều kiện không ion hóa hoàn toàn để tạo Al+3 tự do.
Trong khi người ta chấp nhận rằng hematein hình thành một phức hợp hay “màu” với Al+3, bản chất hay cấu trúc của phức hợp này vẫn chưa được làm sáng tỏ. Tỷ lệ ion Al+3 với phân tử hematein cũng như điện tích chung của phức hợp hematein-Al+3 đã là chủ đề tranh luận hơn 50 qua. Tuy nhiên, hầu hết các bằng chứng ủng hộ khái niệm rằng phức hợp hematein-Al+3 được tích điện dương hay “ion dương-cationic” trong hầu hết các điều kiện nhuộm.
Ngoài các chất ô xi hóa và muối nhôm được mô tả ở trên, dung dịch hematoxylin thường chứa các chất phụ gia và tác nhân khác. Các cải biến dung môi được thực hiện bởi bổ sung polyhydroxy alcohols như glycerin hoặc phổ biến hơn là ethylene glycol. Ban đầu người ta đề xuất rằng polyhydroxy alcohols hoạt động như chất làm ổn định để giảm sự ô xi hóa quá mức hematein. Tuy nhiên, thực tế những chất phụ gia này hoạt động để tăng sự hòa tan của hematein và phức hợp hematein-Al+3 trong dung dịch. Mặc dù hematoxylin tan tương đối trong nước, hematein và phức hợp hematein-Al+3 chỉ tan rất ít trong nước. Hematein và hematein-Al+3 có thể kết tủa và tạo thành một cặn hoặc một ánh kim trên bề mặt dung dịch. Việc bao gồm ethylene glycol trong dung dịch giảm sự kết tủa hay lắng đọng của những sản phẩm này và bởi vậy tăng tính ổn định và thời gian sử dụng của dung dịch hematoxylin.
Một số axit đôi khi được bổ sung vào dung dịch để giảm pH. Axit axetic được bổ sung vào hematoxylin kiểu Gill trong khi axit citric được thấy trong công thức Mayers. Việc bổ sung axit vào dung dịch hematoxylin làm tăng độ nhạy của thuốc nhuộm với axit nuclei do giảm nhuộm nền không đặc hiệu. Ảnh hưởng của việc giảm pH lên thuốc nhuộm được thảo luận chi tiết hơn ở phần “Cơ chế nhuộm” bên dưới.
Cơ chế nhuộm hematoxylin
Nhiều giả thuyết khác nhau đã được đề xuất để chịu trách nhiệm cho hiện tượng nhuộm axit nucleic của phức hợp hematein-Al. Các phân tử trong nhân đã được đề xuất gắn với phức hợp hematein-Al bao gồm protein cơ bản (tích điện dương) như histones cũng như phân tử deoxyribonucleic acid (DNA). Hiện tại có rất ít bằng chứng hỗ trợ đề xuất rằng protein nhân cơ bản gắn với phức hợp hematein. Bằng chứng phù hợp hơn với giả thuyết rằng phức hợp hematein-Al+3 gắn với ADN. Bằng chứng ủng hộ giả thuyết này bao gồm các nghiên cứu sử dụng enzyme DNAse. Những nghiên cứu này đã chứng minh rằng sự phân giải ADN nhân ngăn cản việc nhuộm tất cả nhân với dung dịch hematein/Al.
Sức hút hay liên kết của phức hợp hematein-Al+3 với DNA có khả năng là do lực hút tĩnh điện của phức hợp hematein-Al+3 mang điện tích dương đối với nhóm phosphate vì những nhóm này mang điện âm trong điều kiện nhuộm. Giả thuyết này cũng phù hợp với quan sát rằng các vị trí ion âm khác như các vị trí được tìm thấy trong mucin và proteoglycans có thể tạo ra màu nền bởi gắn với hematein-Al+3. Thực vậy, nhuộm nền có thể giảm thấp bởi hạp thấp pH của dung dịch nhuộm hematein-Al+3. Có thể bổ sung H+ để hạ thấp pH dung dịch và do đó nhiều vị trí này sẽ trở nên trung tính. Thực tế những chất này khi trung hào điện tích sẽ không gắn với phức hợp hematein-Al+3.
Người ta đề xuất rằng chỉ với lực hút tĩnh điện đơn giản không đủ để giúp dung dịch Al/hematein nhuộm ADN nhân tế bào. Giả thuyết này dựa trên sự tin tưởng rằng lực hút tĩnh điện trung gian ban đầu tạo ái lực của phức hợp hematein-Al+3 với ADN nhưng về sau thì lực này được thay thế bằng lực liên kết cộng hóa trị hoặc phối hợp với liên kết cộng hóa trị ổn định hơn. Tuy nhiên, có rất ít bằng chứng trực tiếp ủng hộ vai trò của sự hình thành liên kết cộng hóa trị trong phức hợp hematein-A+3 với ADN.
Trên đây là bài viết về nguyên lý nhuộm axit nucleic bằng hematoxylin. Bài viết do chúng tôi lược dịch từ website của hãng Leica. Chúng tôi rất mong bài viết này sẽ hữu ích với Quí khách. Ngoài ra chúng tôi nhân đấy giới thiệu một số sản phẩm mà chúng tôi cung cấp như: Tủ thao tác IVF, IVF chamber, kính hiển vi huỳnh quang, hóa chất nhuộm sống chết tế bào… Chúng tôi rất mong nhận được sự hỗ trợ và ủng hộ của Quí khách.
