Cố định mô tế bào
Tầm quan trọng của cố định mô
Mục tiêu lớn của cố định mô là bảo tồn tế bào và các thành phần trong mô ở “trạng thái như khi còn sống” và thực hiện theo một cách để cho phép chuẩn bi các lát mô nhuộm, mỏng. Dĩ nhiên trong quá trình cố định và các bước tiếp theo có nhiều thay đổi đáng kể về thành phần và sự xuất hiện của các thành phần tế bào và mô và chính những biến đổi này là nó càng không giống trạng thái tự nhiên. Tuy nhiên, cần cẩn thận để tạo các đặc điểm vật lý và hóa học nhất quán trong các phần mô, việc này cho phép quan sát được các kiểu, hình thái, thay đổi hóa học điển hình có thể được chú ý và so sánh. Những quan sát này cho phép chúng ta thấy một môi trường thay đổi năng động được cố định ở một thời điểm cụ thể, và có thể có vai trò trong chuẩn đoán giải phẫu bệnh.
Đối với mục đích thực tế, việc cố định nhằm ngăn cản hoặc dừng quá trình thoái hóa ngay khi mô bị thiếu nguồn cung cấp máu. Tự ly giải dẫn tới phân hủy mô bởi các enzyme nội bào được giải phóng khi màng bào quan vỡ, và sự phân giải của vi khuẩn có trong mẫu, đây là các hiện tượng cần được ngăn chặn. Mất hoặc sự khuếch tán các chất hòa tan phải được tránh tối đa có thể bằng cách tủa hoặc đông tụ những thành phần này hoặc bởi liên kết chéo chúng với các thành phần cấu trúc không tan khác. Mô phải phải được bảo vệ chống lại ảnh hưởng xấu của quá trình xử lý mô bao gồm sự xâm nhập của sáp nóng, nhưng quan trọng là vẫn duy trì được phản ứng với thuốc nhuộm hoặc các tác nhân khác bao gồm kháng thể và các đầu dò ADN.
Quan trọng nhận ra rằng một chất cố định sẽ bắt đầu tạo một số thay đổi với mô trong môi trường thường là nước. Chúng bao gồm co lại, trương lên và sự cứng lại của các thành phần khác nhau. Mặc dù những ảnh hưởng ban đầu này, mô sẽ trải qua nhiều biến đổi hơn nữa trong quá trình xử lý khi chúng được đặt vào trong một môi trường với dung môi không phải là nước. Đối với cố định mẫu trong 10% formalin ban đầu gây ra trương nhẹ mẫu mô. Tuy nhiên trong quá trình xử lý mẫu có thể co lại 20-30% thể tích của nó. Chất cố định cụ thể được sử dụng sẽ ảnh hưởng tới mức độ mà mỗi thành phần riêng biệt sẽ nhuộm với các tác nhân hóa mô và hóa mô miễn dịch khác nhau. Bởi vậy ảnh hưởng tổng thể lên các mô của một chất cố định cụ thể nên được đánh giá sau khi một mô được xử lý, được cắt và được nhuộm để chứng minh các yếu cố cần thiết.
Kiểu cố định
Việc cố định mô có thể được thực hiện bởi các phương pháp vật lý và hóa học. Các phương pháp vật lý bao gồm nhiệt, vi sóng và bảo quản lạnh (đông khô). Cố định bằng nhiệt hiếm khi được sử dụng trên mẫu mô, sự ứng dụng của nó chỉ hạn chế với phiến tiêu bản mẫu vi khuẩn (smear). Yuy nhiên, cố định bằng vi sóng, có thể được coi là một hình thức cố định nhiệt, hiện nay được sử dụng rộng rãi và thường quy trong phòng thí nghiệm và sẽ được thảo luận ở bên dưới. Bảo quản lạnh (Cryo-preservation), luôn ở dạng đông khô có một số ứng dụng trong hóa mô nhưng không luôn được áp dụng cho mẫu mô chẩn đoán.
Cố định hóa học luôn được thực hiện bằng cách nhúng mẫu chìm trong chất cố định hoặc, trong trường hợp động vật nhỏ hoặc toàn bộ cơ quan như một cái phổi, bởi tưới hệ thống mạch với chất cố định. Đối với một số quy trình hóa mô đặc biệt các chất cố định đôi khi được áp dụng theo dạng hơi. Ví dụ paraformaldehyde và osmium tetroxide có thể được sử dụng để cố định theo dạng hơi với mẫu mô đông lạnh khô.
Dung dịch cố định có thể chứa một tác nhân cố định duy nhất được hòa tan trong một dung môi như nước hoặc cồn hoặc một số dung dịch khác phổ biến hơn như một dung dịch đệm để ổn định pH. Một số dung dịch chất cố định phổ biến chứa một số tác nhân cố định kết hợp với nhau, lý do là sự khiếm khuyết của tác nhân này có thể được bù bởi khả năng của chất cố định khác. Đối với một số acetic acid có mặt trong một số công thức để chống lại sự co lại của mẫu gây ra bởi một số tác nhân khác như ethanol.
Cơ sở lý thuyết của cố định
Cố định có thể được xem như một chuỗi các sự kiện hóa học phức tạp. Mặc dù hiện nay chúng ta có thể xác định một số trong các sự kiện này, hiểu biết của chúng ta về những gì sảy ra trong quá trình cố định vẫn chưa đầy đủ. Tế bào và các thành phần ngoại bào chứa các peptide và protein, lipid và phospholipid (màng), phức hợp carbohydrates và carbohydrate, nhiều kiểu RNA và DNA… Những thành phần này sẽ phản ứng như thế nào trong quá trình cố định sẽ phụ thuộc vào kiểu cố định, tác nhân cố định được sử dụng và điều kiện cố định. Một số thành phần mô sẽ phản ứng hóa học với chất cố định, được làm bền bởi liên kết chéo và bởi vậy được bảo vệ, một số khác có thể không bị ảnh hưởng bởi chất cố định nhưng bị bắt giữ trong tế bào hoặc mô bởi các thành phần cố định khác.
Phân loại tác nhân cố định và cơ chế của cố định
Các tác nhân cố định truyền thống được gọi với thuật ngữ “chất gây đông tụ-coahulant” và “chất không gây đông tụ-non-coagulant” dựa trên ảnh hưởng của chúng lên sự hòa tan protein trong dung dịch. Các chất cố định gây đông tụ được cho rằng dẫn đến sự kết dính các chuỗi protein trong khi chất cố định không gây đông tụ là các chất phụ gia trong tự nhiên, hình thành các liên kết chéo tạo một loại gel ít thấm. Những thuật ngữ này vẫn được bắt gặp trong y văn mô học hiện đại nhưng một cách tiếp cận hệ thống hơn đã được đưa ra cho phân loại.
Có hai cơ chế chính mà quan trọng trong cố định protein và các phức hợp protein: biến tính, và bổ sung và hình thành các liên kết chéo.
Biến tính: Thông thường nhất ảnh hưởng này được gây ra bởi các chất khử nước như rượu và acetone. Những tác nhân này loại bỏ và thay thế nước tự do trong tế bào và mô và gây ra một sự thay đổi trong cấu trúc bậc ba của protein do làm mất ổn định liên kết kỵ nước. Những vùng kỵ nước, thường được thấy bên trong của phân tử protein, được giải phóng khỏi lực đẩy của nước và trở nên tự do sẽ chiếm một vùng lớn hơn. Trong vùng ưa nước của protein được ràng buộc lỏng lẻo với nhau bởi liên kết hydro, việc loại bỏ nước cũng gây mất ổn định các liên kết này. Những thay đổi được tạo ra trong cấu trúc phân tử protein gây ra một sự thay đổi về độ hòa tan protein, khiến protein tan trong nước mất tính tan, một thay đổi mà hầu như không thể đảo nước nếu protein được đưa trở lại môi trường nước.
Bổ sung và hình thành liên kết chéo: Các chất cố định không gây đông tụ phản ứng hóa học với protein và các thành phần tế bào và mô khác, trở nên được gắn kết với chúng bởi sự bổ sung và hình thành các liên kết chéo giữa các phân tử và nội phân tử. Bởi vì những tác nhân này là hợp chất phản ứng chúng gắn với nhiều nhóm hóa học khác nhau trong mô, thường ảnh hưởng tới điện tích ở vị trí gắn. Điều này có thể có một ảnh hưởng lên các đặc tính nhuộm sau đó của một protein cụ thể cũng như thay đổi cấu trúc phân tử và độ hòa tan của nó. Ví dụ, mô được cố định với formaldehyde nhuộm kém với eosin bởi vì formaldehyde phản ứng hầu hết với nhóm amino để hình thành lên cầu methylene và bởi vậy những nhóm này không còn sẵn có để gắn với thuốc nhuộm điện tích âm như eosin.
Mức độ chất cố định phụ gia hình thành liên kết chéo khác nhau đáng kể. Ví dụ glutaraldehyde là hiệu quả hơn khi hình thành liên kết chéo so với formaldehyde. Điều này giải thích tại sao nó bảo tồn hiệu quả siêu cấu trúc của tế bào và là chất cố định được lựa chọn cho kính hiển vi điện tử. Nó cũng giải thích tại sao mô được cố định bởi glutaraldehyde nhuộm kém với các phương pháp nhuộm hóa chất truyền thống. Các phản ứng hóa học của cố định mô được hiểu khá rõ trong trường hợp của một số tác nhân như formaldehyde nhưng kiến thức của chúng ta về cơ chế bao gồm với một số tác nhân khác là chưa toàn diện.
Các phương pháp thu hồi kháng nguyên trong hóa mô miễn dịch được chỉ ra rằng một số các phản ứng của cố định là nghịch đảo, đặc biệt những cái cố định bằng formaldehyde, nhưng có một sự khác nhau đáng kể về chất lượng của bảo tồn kháng nguyên với các tác nhân khác nhau. Sự bảo tồn kháng nguyên trở thành một xem xét rất quan trọng khi chọn chất cố định.
Trên đây là bài viết về nguyên lý cố định mô tế bào. Chúng tôi rất hy vọng bài viết sẽ hữu ích với Quí khách hàng.