Giới thiệu về Digital PCR
Kỹ thuật digital PCR hay cong gọi là PCR kỹ thuật số cho phép định lượng nucleic acid một cách chính xác với độ nhạy cao. Phương pháp PCR truyền thống là một phân tích đóng (end-point) bán định lượng vì sản phẩm khuếch đại chỉ được phát hiện bằng điện di gel agarose. Real-time PCR (hoặc qPCR) sử dụng sự phát huỳnh quang để cho phép đo lượng sản phẩm khuếch đại tích lũy khi phản ứng diễn ra. qPCR yêu cầu có các chỉ số thông thường để kiểm soát (thông số tham chiếu hoặc một đường chuẩn), chỉ cho phép định lượng một cách tương đối. Hơn nữa, những thay đổi trong hiệu suất khuếch đại có thể ảnh hưởng đến kết quả của qPCR.
Digital PCR được xây dựng trên cơ sở PCR truyền thống và phương pháp phát hiện dựa vào đầu dò huỳnh quang để cung cấp khả năng định lượng tuyệt đối nucleic acid với độ nhạy cao mà không cần sử dụng đường cong chuẩn. Với Hệ thống Droplet digital PCR, mẫu được phân chia thành 20.000 giọt nhỏ (có thể bỏ tên hệ thống, chỉ ghi chung chung). Sau khi khuếch đại, các giọt nhỏ chứa đoạn DNA đích được phát hiện bằng huỳnh quang và được ghi nhận là dương tính, các giọt không phát huỳnh quang được ghi nhận là âm tính. Phân tích thống kê Poisson số lượng của giọt âm tính và dương tính sẽ có kết quả định lượng tuyệt đối của đoạn DNA đích
Nguyên lý Digital PCR
Digital PCR cải thiện độ nhạy của qPCR và cho phép phát hiện các tác nhân hiếm gặp như đột biến đơn nucleotide trong một quần thể chuỗi DNA kiểu dại (wide-type). Trong qPCR thông thường, tín hiệu từ chuỗi kiểu dại (wild-type) có thể chiếm ưu thế và che khuất tín hiệu từ chuỗi hiếm gặp. Bằng cách giảm thiểu cạnh tranh giữa các chuỗi đích, digital PCR vượt qua được những khó khăn vốn có trong quá trình khuếch đại các chuỗi hiếm và cho phép xác định số lượng nucleic acid chính xác với độ nhạy cao
Một bước quan trọng trong digital PCR là phân chia mẫu – sự phân tách mỗi mẫu vào các tiểu đơn vị riêng biệt trước khi khuếch đại bằng PCR. Mẫu được chuẩn bị tương tự như đối với Real-time PCR nhưng sau đó được tách thành hàng ngàn phần nhỏ, mỗi phần có thể không chứa, có chứa một hay một vài phân tử mẫu. Mỗi phần nhỏ này hoạt động như một phản ứng PCR riêng và, giống như Real-time PCR, đầu dò huỳnh quang được sử dụng để xác định chuỗi DNA đích được khuếch đại. Mỗi phần được phân tích sau PCR để xác định có hoặc không chứa chuỗi đích.
Các mẫu có chứa sản phẩm khuếch đại được coi là dương tính (1, có huỳnh quang), những phần không có sản phẩm và do đó không có hoặc có ít huỳnh quang là âm tính (0). Tỷ lệ mẫu dương/ âm tính trong mỗi mẫu là cơ sở của việc định lượng.
Không giống như qPCR, digital PCR không dựa vào số chu kỳ để xác định lượng nucleic acid trong mỗi mẫu, thay vào đó nó dựa vào thống kê Poisson để xác định tuyệt đối số lượng mẫu.
Bước phân chia mẫu của digital PCR kết hợp với phân tích dữ liệu Poisson cho phép độ chính xác cao hơn phương pháp PCR truyền thống và qPCR. Theo đó, digital PCR đặc biệt thích hợp cho các ứng dụng đòi hỏi phải phát hiện một lượng nhỏ nucleic acid đầu vào hoặc xử lý tốt hơn lượng đích trong mẫu như phát hiện các chuỗi hiếm, phân tích số bản sao (copies) (CNV) và phân tích biểu hiện gen các chuỗi mục tiêu hiếm.
Ứng dụng của Digital PCR
Phân chia mẫu trong hệ thống ddPCR cho phép phát hiện các phân tử xác định đặc hiệu và nhạy của phân tử mẫu đơn và định lượng chính xác đồng thời giảm thiểu các ảnh hưởng của sự cạnh tranh đích, làm cho khuếch đại PCR ít nhạy hơn với chất ức chế và cải thiện đáng kể khả năng phân biệt các thí nghiệm khác nhau chỉ một nucleotide. Digital PCR mang lại những lợi ích đáng kể so với các phương pháp PCR khác: định lượng tuyệt đối và tăng cường độ nhạy và dải động học. Nhờ độ nhạy cao, độ chính xác và định lượng tuyệt đối, digital PCR mở rộng phạm vi phân tích nucleic acid vượt qua khả năng của các phương pháp khác trong một số ứng dụng:
– Sinh thiết lỏng (liquid biopsy)
– Phân tích số copies (Copy number variation/ CNV)
– Phát hiện chuỗi trình tự hiếm
– Biểu hiện gen và phân tích miRNA
– Phân tích tế bào đơn
– Phát hiện bệnh
– Phân tích thư viện Giải trình tự thế hệ mới NGS
Chúng tôi hy vọng bài viết trên đây phần nào giúp quí khách hiển rõ hơn về digital PCR. Chúng tôi cung cấp nhiều sản phẩm cho phòng labo y học như: kit tach ADN, hóa chất nhuộm papanicolaou, hóa chất nhuộm sống chết tinh trùng, hóa chất lọc rửa tinh trùng… Chúng tốt mong nhận được ủng hộ và hỗ trợ từ quí khách.
