Enzyme giới hạn
Enzyme giới hạn hay còn gọi là enzyme cắt giới hạn có vai trò rất quan trọng trong sự phát triển của công nghệ sinh học. Chúng là có bản chất là protein những có khả năng nhận diện chính xác một đoạn trình tự ADN ngắn và cắt chính xác phân tử ADN ở vị trí đặc hiệu. Bởi vậy nói không ngoa rằng enzyme cắt giới hạn cùng với ligase đã tao nên ngành công nghệ ADN tái tổ hợp. Trong bài viết này chúng tôi sẽ giúp các bạn tìm hiểu kỹ hơn về enzyme cắt giới hạn.
Lịch sử của enzyme giới hạn
Vào đầu những năm 1950, một số nhóm nghiên cứu đã quan sát thấy sự khác biệt trong hiệu quả của gây nhiễm thực khuẩn thể vào các dòng vi khuẩn chủ khác nhau của cùng loài. Hiện tượng này được mô tả bởi Grasso và Paigen: khi phage λ được nhân giống trong một dòng vi khuẩn (ví dụ, E. coli C) được sử dụng để nhiễm vào một chủng khác cùng loài vi khuẩn (ví dụ E. coli K), một tỷ lệ lây nhiễm giảm đáng kể khi được so sánh với việc tái lây nhiễm vào dòng chủ ban đầu (E. coli C). Dòng vi khuẩn chủ mới (E. coli K) có vẻ chống lại hoặc giới hạn sự xâm nhập của Phage. Các nhà nghiên cứu cũng thấy đây không phải hiện tượng di truyền, bởi vì phage mà phát triển trên dòng mới có thể nhiễm chủng vi khuẩn đó ở tỷ lệ điển hình hơn sau một vòng lây nhiễm. Hiện tượng được quan sát được xác định như sự biến đổi kiểm soát vật chủ và trở thành một lĩnh vực nghiên cứu quan tâm để khám phá cơ chế ẩn sâu trong đó.
Cho tới tận những năm 1960 cơ chế bên dưới sự biến đổi kiểm soát vật chủ mới được xác định là sự phân cắt ADN phage của enzyme, việc này dẫn tới sự khám phá và phân lập được các enzyme giới hạn. Vào đầu những năm 60 của thế kỷ trước, Werner Arber quan sát thấy rằng yếu tố quyết định phổ vật chủ nằm trên ADN của Phage, và các thí nghiệm sau đó chỉ ra rằng methionine được bao gồm trong việc bảo vệ vật chủ. Những kết quả này cuối cùng dẫn tới đề xuất một hệ thống sửa đổi hạn chế (R-M restriction-modification), trong đó một enzyme giới hạn và methylase từ vật chủ làm việc cùng nhau để phân cắt ADN virus ngoại sinh (mà không bị methyl hóa) trong khi vẫn giữ ADN vật chủ được bảo vệ thông qua sự methyl hóa.
Đáng chú ý, hầu hết công trình đầu tiên về hệ thống sửa đổi hạn chế R-M trên các nhóm enzyme giới hạn kiểu I và III, được phân loại dựa trên cấu trúc và chức năng của chúng. Tuy nhiên, sự hữu dụng hoàn toàn của enzyme giới hạn chưa trở nên rõ ràng cho tới khi Kent Wilcox và Hamilton Smith khám phá ra HindII, enzyme cắt giới hạn đầu tiên thuộc kiểu II. HindII nhận ra một trình tự ADN đối xứng và cắt theo một cách xác định trong trình tự nhận biết đó. Đặc tính này được thấy trong hầu hết các enzyme giới hạn kiểu hai ban đầu, dẫn Kathleen Danna và Daniel Nathans tới sử dụng HindII trong lập bản đồ vật lý của ADN SV40 (simian virus 40), và quy trình này được biết như lập bản đồ bằng enzyme giới hạn.
Nhờ những công trình tiên phong sử dụng enzyme giới hạn, Daniel Nathans, Hamilton Smith, và Werner Arber được trao giải thưởng Nobel về Sinh lý và Y học năm 1978. Cùng với việc khám phá ra DNA ligase, enzyme giới hạn mở ra kỷ nguyên của công nghệ ADN tái tổ hợp.
Quy ước đặt tên enzyme giới hạn
Quy ước đặt tên xem xét ba điểm là nguồn gốc sinh vật của enzyme – chi, loài, và chủng hoặc serotype — để phát triển một tên ngắn gon bằng cách đánh số để thể hiện nhiều enzyme cắt giới hạn từ cùng một chủng. Ví dụ, enzyme HindIII (hay Hind III theo danh pháp trước đây) thể hiện:
- “H” là viết tắt của Haemophilus
- “in” là viết tắt ủa influenzae
- “d” nghĩa là serotype d
- “III” để phân biệt với các enzyme cắt giới hạn khác với Haemophilus influenza serotype d (ví dụ, HindII với HindIII)
Phân loại enzyme cắt giới hạn
Enzyme cắt giới hạn được phân thành bốn loại, dựa trên sự phức tạp về cấu trúc, trình tự nhận biết, vị trí cắt, và cofactor được yêu cầu. Bảng dưới đây tổng kết các đặc điểm khác nhau giữa các loại.
| Loại Enzyme | Đặc tính |
|---|---|
| Kiểu I (Type I) |
|
| Kiểu II
(Type II) |
|
| Kiểu III
(Type III) |
|
| Kiểu IV
(Type IV) |
|
Bởi vì các đặc tính đặc hiệu của enzyme giới hạn loại II, chúng đã trở nên được sử dụng phổ biến nhất trong nhiều ứng dụng nghiên cứu như nhân dòng và phân tích ADN cho lĩnh vực pháp y. Kiểu cắt đặc hiệu của những enzyme này dẫn tới việc sử dụng chúng trong phân tích đa hình độ dài các đoạn cắt giới hạn (restriction fragment length polymorphism-RFLP), và đó là cơ sở của các nghiên cứu pháp y. Ligase là enzyme kết nối đầu 5′ phosphate và 3′ hydroxyl của hai đoạn phân tử ADN, giúp có thể tái sắp xếp và cấu trúc lại phân tử ADN sau khi bị cắt bởi enzyme giới hạn – đây là nguyên lý cơ bản của ADN tái tổ hợp.
Do sự hữu ích của chúng trong nghiên cứu sinh học phân tử, enzyme cắt giới hạn kiểu II là loại enzyme được nghiên cứu nhiều nhất và là nhóm lớn nhất. Hơn 3,500 enzyme giới hạn lớp II đã được xác định đặc tính và phân loại tiếp thành các nhóm như Type IIP, IIA, IIB, IIC, IIS…, trong đó enzyme Type IIP, nhận ra trình tự đích đối xứng, là dạng enzyme được sản xuất và thương mại hóa lớn nhất trên thị trường.
Vị trí nhận biết và sự phân cắt đặc hiệu
Một cách quan trọng khác để phân loại và so sánh enzyme cắt giới hạn là isoschizomer và neoschizomer.
- Isoschizomer là các enzyme giới hạn mà có cùng vị trí nhận biết và cùng sự đặc hiệu. Ví dụ, AgeI và BshT1 dều nhận và phân cắt tại trình tự 5′-A↓CCGGT-3′. Tuy nhiên, một bộ isoschizomers có thể khác nhau trong sự ưu tiên vị trí, điều kiện phản ứng, độ nhạy methyl hóa, và hoạt động sao (star activity).
- Neoschizomers nhận ra cùng trình tự nhưng cắt ADN ở các vị trí khác nhau. Ví dụ một bộ neoschizomer là SmaI (5′-CCC↓GGG-3′) và XmaI (5′-C↓CCGGG-3′), trong đó cả hai nhận ra 5′-CCCGGG-3′ nhưng chúng lại cắt ở vị trí khác nhau và bởi vậy tạo các kiểu đầu khác nhau (trong trường hợp này, đầu bằng với SmaI và đầu 5′ thò ra đối với XmaI).
Do có nhiều enzyme với sự đặc hiệu khác nhau ở cả trình tự nhận biết và kiểu phân cắt khiến cho enzyme giới hạn trở thành một công cụ cực kỳ linh hoạt và mạnh mẽ trong thao tác vật liệu di truyền.
Trên đây là bài viết tổng quan về Enzyme cắt giới hạn. Chúng tôi rất mong bài viết này sẽ hữu ích với Quí khách. Ngoài ra chúng tôi còn cung cấp nhiều hóa chất thiết bị sinh học như: cao nấm men, thạch bột ngô, kháng sinh kanamycin, máy đo CO2 và O2, pen-strep, … Chúng tôi rất mong nhận được sự hỗ trợ và ủng hộ của Quí khách.
