Phương pháp nhuộm Gram
Nguyên lý của nhuộm gram
Nhuộm gram bao gồm ba quy trình: nhuộm với một thuốc nhuộm tan trong nước được gọi là tím kết tinh (crystal violet), khử màu, và nhuộm hóa chất tương phản, thường là với safanin. Do sự khác nhau về độ dày của lớp peptidoglycan trong màng tế bào giữa Gram dương và gram âm, vi khuẩn gram dương (với một lớp peptidoglycan dày hơn) giữ lại tím kết tinh trong quá trình khử màu, trong khi vi khuẩn gram âm mất màu tím kết tinh và được nhuộm màu của safarin trong quy trình nhuộm cuối cùng. Quy trình này bao gồm ba bước:
- Tế bào được nhuộm với thuốc nhuộm tím kết tinh. Tiếp theo, một dung dịch iốt (iodine và potassium iodide – dung dịch lugol) được bổ sung vào để tạo một phức hợp giữa i ốt và tím kết tinh. Phức hợp này là một phân tử lớn hơn tím kết tinh ban đầu và iốt và không tan trong nước.
- Chất khử màu như ethyl alcohol hoặc acetone được bổ sung vào mẫu, nó loại nước trong lớp peptidoglycan, làm nó co lại và thắt chặt vào. Phức hợp tím kết tinh iốt không thể đi ra khỏi lớp peptidoglycan đã co lại, và bởi vậy nó bị giữ lại trong tế bào của vi khuẩn gram dương. Ngược lại, màng ngoài của vi khuẩn gram âm bị hủy hoạt và lớp peptidoglycan mỏng hơn của nó không thể giữ phức hợp tím kết tinh iốt và do đó màu bị mất.
- Một thuốc nhuộm tương phản, như safranin tan kém trong nước, được bổ sung vào mẫu, nó có màu đỏ. Vì safranin nhẹ hơn crystal violet, nó không phá vỡ màu tím trong tế bào gram dương. Tuy nhiên, tế bào gram âm được khử màu ở bước trước sẽ được nhuộm màu đỏ của safarin.
Quy trình nhuộm gram:
Hóa chất:
- Tím kết tinh (nhuộm đầu tiên)
- Dung dịch iốt/ Lugol (chất bắt thuốc nhuộm mà cố định tím kết tinh trong thành tế bào)
- Chất khử màu (ví dụ cồn-ethanol)
- Safranin (thuốc nhuộm thứ hai)
- Nước (ưu tiên trong chai cổ vịt)
- Đặt mẫu trên lam kính để khô tự nhiên để chuẩn bị nhuộm. Hơ nóng lam kính chứa mẫu hai hoặc ba lần trên đèn cồn hoặc đèn Bunsen để mẫu bám chặt vào lam.
- Bổ sung thuốc nhuộm đầu tiên (tím kết tinh) vào mẫu/ lam kính và ủ trong một phút. Rửa lam với một dòng nước nhẹ tối đa trong năm giây để loại bỏ tím kết tinh không được bắt giữ.
- Bổ sung dung dịch iốt trong 1 phút – nó là một chất bắt nhuộm, hoặc một tác nhân mà cố định tím kết tinh vào thành tế bào vi khuẩn.
- Rửa mẫu/ lam kính với acetone hoặc alcohol trong 3 giây và rửa với một dòng nước nhẹ. Cồn sẽ khử màu mẫu nếu nó là vi khuẩn gram âm, do loại bỏ tím kết tinh. Tuy nhiên, cần chú ý rằng nếu sử dụng cồn quá lâu màu tím kết tinh trên vi khuẩn gram dương có thể bị loại bỏ.
- Bổ sung thuốc nhuộm thứ hai, safranin, ủ lam kính trong khoảng 1 phút. Rửa với một dòng nước nhẹ tối đa 5 giây. Nếu vi khuẩn là gram dương, nó sẽ giữ nguyên màu nhuộm đầu tiên (tím kết tinh) và không hấp thụ thuốc nhuộm thứ hai (safranin), khiến nó nhìn có màu tím dưới kính hiển vi. Nếu là vi khuẩn gram âm, nó sẽ mất màu nhuộm đầu tiên và hấp thụ màu nhuộm thứ hai, khiến nó có màu đỏ khi nhìn dưới kính hiển vi.
Trên đây là bài viết tổng quan về quy trình nhuộm gram. Chúng tôi rất hy vọng bài viết sẽ hữu ích cho Quí khách hàng. Ngoài ra chúng tôi cung cấp một hóa hóa chất vật tư sinh học như: Indigo carmine, thạch chocolate, thạch nutrient, trypton water, MHA agar… Chúng tôi rất mong nhận được sự hỗ trợ và ủng hộ của Quí khách.
