Sinh thiết lỏng với Digital PCR và giải trình tự thế hệ mới NGS
Việc phát hiện ra rằng DNA khối u tự do (ctDNA) có thể được tìm thấy trong máu, nước tiểu và các chất dịch cơ thể khác của bệnh nhân ung thư đã mang đến một loại sinh thiết mới vượt qua được sinh thiết bằng phẫu thuật – là sinh thiết lỏng (liquid biopsy). Tuy nhiên, rất khó đo được một phần rất nhỏ của ctDNA trong sinh thiết lỏng giữa rất nhiều cfDNA (cell-free DNA) tiết ra từ các tế bào bình thường. Gần đây, người ta đã chỉ ra rằng sinh thiết lỏng cell-free, đặc biệt là cfDNA trong huyết tương, là một xét nghiệm hợp lệ cho genotyping ung thư và có khả năng định hướng các kế hoạch điều trị ung thư.
Thông qua sự kết hợp của Giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) và PCR kỹ thuật số (digital PCR – dPCR), sinh thiết lỏng đã sẵn sàng trở thành tiêu chuẩn trong chẩn đoán ung thư. Các công nghệ này cùng nhau cung cấp khả năng phát hiện, định lượng và giải trình tự một lượng nhỏ DNA cần thiết để liên kết kiểu gen ung thư với các phương pháp điều trị đã có.
NGS và digital PCR cung cấp một bức tranh toàn cảnh về gen ung thư
Do ung thư có rất nhiều loại và phức tạp, những công cụ phân tích đột biến hiệu quả là rất cần thiết cho nghiên cứu và điều trị. Cái nhìn toàn cảnh toàn bộ trình tự bộ gen của NGS kết hợp với phát hiện chính xác của dPCR cung cấp một bức tranh toàn diện về cấu tạo gen ung thư. Bằng cách áp dụng các kỹ thuật bổ sung này vào thời điểm thích hợp dựa trên loại bệnh và giai đoạn, các bác sĩ có thể điều trị ung thư nhanh hơn, chính xác hơn và hiệu quả hơn về mặt chi phí.
Thông qua giải trình tự hệ gen hoặc một phần gen, NGS có thể phát hiện những đột biến không thể lường trước để đưa ra quyết định điều trị. Thông tin từ NGS có thể cho phép các nhà nghiên cứu xác định những đột biến thứ phát phát sinh sớm trong quá trình phát triển của khối u có thể giúp theo dõi tái phát khối u.
Một hạn chế là quá trình NGS còn chậm, có thể dẫn đến sự chậm trễ trong việc thu được kết quả của bệnh nhân và không hấp dẫn về mặt kinh tế như một xét nghiệm để theo dõi liên tục.
Xác định kiểu gen với một tập hợp nhỏ hơn các marker gen đã biết nhạy hơn, tiết kiệm hơn và nhanh hơn với PCR kỹ thuật số dạng giọt (Droplet Digital PCR – ddPCR) QX200 system (Bio-Rad Laboratories, Hercules, Calif.). Thông qua một phản ứng ddPCR đa cặp mồi, có thể khảo sát nhiều gen và phát hiện đồng thời 5-10 đột biến. ddPCR xác định và định lượng chính xác DNA mục tiêu trong sinh thiết lỏng, và do đó thường được sử dụng để xác nhận kết quả NGS. ddPCR cung cấp kết quả xác định các bản sao (tuyệt đối) trên mỗi ml huyết tương, cả đột biến ung thư và bản sao của nó.
Báo cáo độc lập của các giá trị ctDNA ít phụ thuộc vào sự biến đổi sinh lý trong mức cfDNA nền và cho phép các nhà cung cấp dịch vụ chăm sóc sức khỏe đánh giá chính xác hơn sự phát triển của ung thư theo chiều dọc cũng như đáp ứng của bệnh nhân với điều trị. NGS, mặt khác chỉ cung cấp một tỷ lệ đột biến cho các bản sao DNA kiểu dại do phải xây dựng thư viện DNA và tiền khuếch đại để giải trình tự.
THEO DÕI CÁC ĐỘT BIẾN ĐỊNH HƯỚNG, KHÁNG THUỐC VÀ TÁI PHÁT
Trong khi một số dạng ung thư có đột biến định hướng khó nắm bắt hơn như khối u ác tính có một tập hợp nhỏ đột biến chỉ thị có thể dự đoán phần lớn ung thư. Với các trường hợp này, khảo nghiệm kiểu gen từ mô hoặc plasma sử dụng multiplex ddPCR có thể nhanh chóng xác định đột biến nguy cơ cao trong ung thư. Bác sĩ có thể thiết kế và thực hiện một kế hoạch điều trị cụ thể cho bệnh nhân dựa trên những kết quả này. Công cụ phân loại kiểu gen này cũng hữu ích cho việc hoạch định kế hoạch điều trị cho các bệnh nhân ung thư phổi không phải là tế bào nhỏ, phần lớn trong số họ có đột biến ở receptor thụ thể thụ thể biểu bì (EGFR) hoặc KRAS.
Khi xác định kiểu gen bằng ddPCR huyết thanh chưa các định được đột biến định hướng hoặc với những khối u với số lương lớn các đột biến xác định, NGS rất quan trọng để lập phác đồ điều trị cá thể. Kỹ thuật cung cấp một cái nhìn toàn cảnh về đột biến định hướng như một thông tin di truyền bổ sung về bệnh nhân. Để xác nhận kết quả NGS, một khảo nghiệm nhạy và xác định đích tốt hơn như ddPCR thường xuyên được sử dụng.
Một lợi ích quan trọng cho bác sỹ là một loạt các ứng dụng của digital PCR để theo dõi một hoặc nhiều hơn những đột biến định hướng trong suốt quá trình điều trị để xác định tính đáp ứng và khả năng tái phát vì mức DNA đột biến tìm thấy trong sinh thiết lỏng đã được tìm ra là có phản ánh kích thước của khối u. Cũng có thể sử dụng NGS để theo dõi quá trình; tuy nhiên, trong những trường hợp này, nó ít khả thi hơn do chi phí và thời gian quay vòng dài hơn.
Trong một nghiên cứu lâm sàng được tiến hành bởi Garcia-Murillas và cộng sự, bệnh nhân ung thư vú ở giai đoạn sớm ban đầu được phát hiện bằng NGS đích của DNA từ sinh thiết mô. Các xét nghiệm ddPCR đặc hiệu cho bệnh nhân sau đó đã xác định được căn bệnh còn sót lại và tiến triển của bệnh theo dõi bằng cách phân tích sự có mặt của ctDNA trong sinh thiết lỏng sau khi điều trị thông thường (Hình 1). Khả năng tái phát bệnh được tiên đoán gần tám tháng sớm hơn bình thường chẩn đoán lâm sàng.
Siravegna và cộng sự kiểm tra sinh thiết lỏng của bệnh nhân ung thư đại trực tràng (CRCs) để xác định động lực đột biến của CRCs được điều trị bằng kháng thể điều trị đặc hiệu cho EGFR.
Các nhà nghiên cứu đã sử dụng ddPCR để điều tra trạng thái đột biến của 7 gen quan trọng trong sự phát triển và kháng CRC. Nghiên cứu này khám phá ra làm thế nào gen CRC đáp ứng phác đồ điều trị một cách không liên tục. Như theo dõi thời gian thực mức ctDNA các đột biến định hướng và kháng thuốc sẽ giúp chúng ta xác định phương pháp điều trị cho bệnh nhân CRC. Khi không thể dự đoán được các đột biến kháng thuốc, NGS là cần thiết để đưa ra cái nhìn toàn cảnh về gen và xác định những đột biến mới quan trọng định hướng sự phát triển của ung thư
Cái nhìn cận cảnh của ddPCR cho phát hiện và theo dõi những đột biến có khả năng phát sinh với độ nhạy cao bổ sung cho cái nhìn chi tiết từ NGS để đánh giá số lượng lớn các đột biến có thể định hướng và kháng thuốc.
THEO DÕI TÁI TỔ HỢP NHIỄM SẮC THỂ TRONG CÁC KHỐI U KHÔNG ĐỒNG NHẤT
Do tính chất không đồng nhất của các khối u và sự phát triển, rất quan trọng để tìm ra chỉ thị gen có mặt trong tất cả các tế bào trong khối u. Lao Saal, Ph.D, Phó giáo sư và Trưởng bộ phận Phát hiện Ung thư học thuộc Bộ phận Ung thư học và Bệnh học tại Trung tâm Ung thư Đại học Lund, mô tả tại sao tái tổ hợp nhiễm sắc thể là chỉ thị quan trọng cho theo dõi ung thư. “Sự tái tổ hợp nhiễm sắc thể thường xảy ra trong quá trình phát triển ung thư. Vì vậy, chúng chia sẻ giữa các dòng tế bào phụ (subclone) và sự sắp xếp lại có trong bản chất của tất cả các loại ung thư”, ông nói. Do đó, sự tái tổ hợp nhiễm sắc thể có thể được sử dụng để theo dõi tất cả các bệnh nhân, trong khi các test dựa trên gen cfDNA không có ý nghĩa trong các trường hợp không có đột biến điển hình.
Sự dung hợp nhiễm sắc thể (đột biến cấu trúc nhiễm sắc) được tìm thấy trong các khối u có thể được sử dụng như các chỉ thị sinh học (biomarker) đơn giản để xác định và theo dõi quá trình ung thư, các SNP hoặc đột biến thêm/ mất có thể không đại diện cho toàn bộ khối u. NGS cho phép các nhà nghiên cứu tạo ra một mạng lưới rộng khắp để xác định sự tái tổ hợp nhiễm sắc thể chỉ thị – nhưng không nhất thiết định hướng sự phát triển khối u – và cho phép theo dõi khả năng của tất cả các tế bào khối u. Với những tái tổ hợp đặc hiệu đã được xác định, Saal có thể chuyển đổi những marker biến thể đặc hiệu thành các thí nghiệm ddPCR với độ nhạy cao, nhanh chóng, tiết kiệm, real-time thông qua sinh thiết lỏng.
Olsson et al. nghiên cứu phát hiện sớm di căn trong ung thư vú. Phát hiện bệnh di căn quá muộn không thể điều trị hiệu quả. Bằng cách theo dõi khoảng một nửa các biến thể cấu trúc sử dụng sinh thiết lỏng với phân tích ddPCR, các nhà nghiên cứu đã phát hiện ra di căn như ba năm trước đó (trung bình là 11 tháng) so với các kỹ thuật thông thường. Họ cũng chứng minh rằng số lượng ctDNA đã tiên đoán được về khả năng tái phát và tử vong. Cách tiếp cận này cũng đang được nghiên cứu bởi các phòng thí nghiệm khác và loại ung thư khác. Reinert và cộng sự phân tích ctDNA ở bệnh nhân CRC sau phẫu thuật. Ung thư đại trực tràng rất khó sinh thiết, thực hiện sinh thiết lỏng đặc biệt thuận lợi cho việc giám sát nối tiếp. Đầu tiên, nhóm của Reinert phân tích các mô khối u với NGS để xác định các biến thể cấu trúc của từng bệnh nhân. Tương tự như nhóm của Olsson, Reinert có thể phát hiện ra sự tái phát của ung thư trung bình 10 tháng trước các phương pháp truyền thống bằng cách chuyển những tái tổ hợp này thành các xét nghiệm ddPCR dễ theo dõi.
CÁC ỨNG DỤNG LÂM SÀNG CỦA SINH THIẾT LỎNG VÀ CHỈ THỊ SINH HỌC (BIOMARKER)
Sinh thiết lỏng cho ung thư thể rắn đang bắt đầu mở rộng ra bên ngoài phòng nghiên cứu. Năm 2015, Biodesix (Boulder, Col.) đã thương mại hóa thử nghiệm sinh thiết lỏng GeneStrat để theo dõi bệnh nhân ung thư phổi không phải là tế bào nhỏ cho các đột biến của gen định hướng EGFR, KRAS và BRAF. Chẩn đoán ung thư có thể được thực hiện trong vòng 72 giờ sau khi lấy mẫu.
Tiện ích lâm sàng của việc sử dụng NGS để khám phá các dữ liệu toàn bộ gen kết hợp với một phương pháp phản ánh thực tế như ddPCR để theo dõi biomarker cụ thể phụ thuộc vào khả năng tìm ra các triệu chứng lâm sàng. Tiến sĩ Hanlee P. Ji, trợ lý giáo sư y khoa của Trường Y Stanford, cho biết: “Nhóm nghiên cứu của chúng tôi rất tập trung vào việc cố gắng tìm ra những yếu tố di truyền là chỉ số tái phát di căn …. Và điều đó rất thiết thực vì từ đó có thể đánh giá rủi ro tiềm tàng cho những người có nhiều khả năng bị bệnh di căn, và do đó bạn sẽ có nhiều khả năng chữa trị cho họ một cách tích cực (trước cả) khi họ bị bệnh giai đoạn đầu. ”
Thông tin trình tự từ NGS cho phép các nhà nghiên cứu xác định được các chỉ số gen có thể có không chỉ đối với sự tái phát di căn mà còn cả sự tấn công của khối u và các đặc tính cơ bản khác của bệnh. Khi xác định được các biomarkers di truyền, một phương pháp ddPCR đơn giản, hiệu quả về chi phí có thể được phát triển để đưa ra các quyết định chẩn đoán và điều trị nhanh hơn.
Bài viết này được lược dịch từ bài viết Improved Liquid Biopsies With Combined Digital PCR and Next-Generation Sequencing của tác giả George Karlin-Neumann. Ngoài ra chúng tôi còn cung cấp nhiều bài viết liên quan tới các lĩnh vực khác như: Lọc rửa tinh trùng, chọc hút noãn, tủ ấm time lapse, nhuộm pap, nhuộm sống chết tinh trùng… Chúng tôi rất hy vọng những thông tin trên hữu ích cho quí khách hàng.
