Hot start PCR
Phản ứng trùng hợp chuỗi đã trở thành một trong các kỹ thuật xương sống của ngành sinh học phân tử. Bằng kỹ thuật PCR chỉ sau khoảng thời gian một giờ đồng hồ có thể sao chép tạo hàng triệu bảng sao của đoạn ADN đích từ một bản sao ban đầu. Tuy nhiên, ngoài các sản phẩm chính trong quá trình PCR sẽ xuất hiện nhiều sản phẩm phụ. Lý do của hiện tượng này là sự bắt cặp không đặc hiệu hoặc các mồi tự bắt cặp nhau và taq pol sẽ tổng hợp lên sản phẩm ở nhiệt độ thấp. Để hạn chế hiện tượng này người ta phát triển phương pháp Hot start PCR. Phương pháp này không những hạn chế sự hình thành sản phẩm phụ mà còn giúp tăng lượng ADN đích mong muốn.
Khuếch đại không đặc hiệu
PCR là một kỹ thuật rất nhạy; tuy nhiên, trước chy kỳ nhiệt (ví dụ trong quá trình trộn phản ứng) dễ sảy ra các phản ứng PCR do sự gắn mồi không đặc hiệu với khuôn ADN, hoặc thậm chí giữa các cặp mồi. Ở nhiệt độ dưới mức tối ưu, hoạt tính polymerase ở mức độ thấp dẫn đến sự kéo dài những trình tự bắt cặp nhầm này, và cuối cùng dẫn đến sự hình thành các sản phẩm không đặc hiệu và primer-dimer. Sự khuếch đại các sản phẩm nền không đặc hiệu giảm sản phẩm ADN đích, vì nucleotide và mồi sẽ được sử dụng cho khuếch đại đoạn phân tử đích đã được sử dụng cho các sản phẩm phụ. Hơn nữa, sự có mặt của các sản phẩm nền cản trở việc phân lập và phân tích sản phẩm đích sau đó.
Phương pháp Hot start PCR
Phương pháp Hot start PCR giảm sự hình thành các sản phẩm không đặc hiệu và các sản phẩm phụ từ primer. Hiện nay có một số cách để thực hiện kỹ thuật hot start PCR. Chi tiết mỗi cách là khác nhau nhưng nhìn chung đều theo nguyên lý hạn chế sự sẵn sàng của một thành phần quan trọng của phản ứng cho tới khi nhiệt độ phản ứng đủ cao để ngăn chặn sự bắt cặp không đặc hiệu. Sau đâu là một số ví dụ về các cách để thực hiện phản ứng hot start PCR.
Loại bỏ các thành phần phản ứng cần thiết: Các thử nghiệm sớm nhất về hot start PCR đơn giản chỉ trì hoãn việc bổ sung polymerase cho tới khi nhiệt độ phản ứng đạt 94°C, khi ADN đã được biến tính hoàn toàn. Mặc dù phương pháp này hoạt động, nó yêu cầu thêm nhiều bước thao tác, rất bất tiện khi thực hiện đồng thời nhiều phản ứng và tăng khả năng nhiễm ADN.
Cô lập các thành phần trong phản ứng: Hầu hết các phương pháp trong nhóm này sử dụng các vật liệu nhạy cảm với nhiệt độ, như hạt sáp hoặc agarose, để tách riêng một thành phần cần thiết (ví dụ, Taq DNA polymerase hoặc MgCl₂) với phần còn lại của hỗn hợp phản ứng. Khi nhiệt độ phản ứng đủ cao để làm nóng chảy sáp hoặc agarose, thành phần cô lập được giải phóng vào trong hỗn hợp, cho phép PCR khởi động. Một phương pháp khác của cô lập bao gồm sự hình thành của tủa Mg. Kết tủa này cô lập ion Mg (cái mà được yêu cầu bởi polymerase) khỏi hỗn hợp phản ứng, và giải phóng chúng khi nhiệt độ phản ứng nằm giữa 50–95°C.
Cải biến hóa học của polymerase: Trong phương pháp hot start này, polymerase bị bất hoạt thuận nghịch bởi cải biến hóa học. Enzyme được tái kích hoạt bởi làm ấm hỗn hợp phản ứng lên 94–95°C trong 9–12 phút. Đây có thể là vấn đề, vì tái kích hoạt nhiệt độ cao có thể dẫn đến depurine của nucleotide của khuôn ADN, giảm chất lượng sản phẩm được tạo ra. Hơn nữa, thời gian tái kích hoạt dài tăng thời gian phản ứng PCR và làm giảm hiệu suất.
Ức chế polymerase qua ligand theo dạng thuận nghịch: Phương pháp hot start hứa hẹn nhất sử dụng một oligonucleotide hoặc một kháng thể ức chế thuận nghịch polymerase. Ức chế qua trung gian phối tử tốt hơn với sự bất hoạt của polymerase so với cải biến hóa học bởi vì không cần bước tái hoạt hóa nhiệt độ cao trong thời gian dài. Hoạt tính enzyme được khôi phục khi phân ly đơn giản hoặc biến tính ở nhiệt độ cao. Hơn nữa, khi sự ức chế bị loại bỏ, hầu hết nếu không muốn nói là tất cả hoạt tính ban đầu của nó.
Trên đây chúng tôi giới thiệu tổng quan về kỹ thuật hot start PCR. Chúng tôi hy vọng bài viết này sẽ hữu ích với Quí khách. Ngoài ra chúng tôi còn mong nhận được sự góp ý và hỗ trợ của Quí khách.
